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| 導(dǎo)讀 | 一個(gè)重要的模式變化在于更多的關(guān)注集中在基因補(bǔ)充策略的改變,包括基因編輯和目標(biāo)基因重組,反義寡核苷酸誘導(dǎo)外顯子跳躍以及... |
基因治療方案和藥物在范圍內(nèi)接連獲批，2017年美國接連批準(zhǔn)了三項(xiàng)基因治療的上市，兩個(gè)基因治療方案和一個(gè)直接給藥型的基因治療藥物。國內(nèi)也不遑多讓，12月8日至12月29日，已有多達(dá)5家企業(yè)的申報(bào)獲得受理，另有一些公司也在積極布局CAR-T免疫療法，有望在2018年申報(bào)臨床。
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基因治療，直面挑戰(zhàn)
世界上*個(gè)獲得授權(quán)的基因轉(zhuǎn)移研究誕生在1989年的NIH（National Insititutes of Health, 國立衛(wèi)生研究院）。在這項(xiàng)標(biāo)志性的研究中，腫瘤浸潤(rùn)的淋巴細(xì)胞被收集起來，用逆轉(zhuǎn)錄病毒進(jìn)行遺傳標(biāo)記用于檢查這些細(xì)胞的“腫瘤歸巢”能力。這一研究為證明“遺傳改變的人類細(xì)胞回輸入病人體內(nèi)后并不對(duì)人體造成傷害“提供了*個(gè)直接證據(jù)。截止到2012年6月，已有31個(gè)國家共1843例臨床試驗(yàn)已獲授權(quán)、啟動(dòng)或已完結(jié)?；仡欉^往，2007年僅有28個(gè)國家的1309例臨床試驗(yàn)，而2004年僅有24個(gè)國家的918例臨床試驗(yàn)。有意思的是，盡管試驗(yàn)的總數(shù)量在逐步增長(zhǎng)，但這期間的增長(zhǎng)率卻在輕微放緩。另外一個(gè)值得注意的差別在于進(jìn)入臨床試驗(yàn)晚期的試驗(yàn)比例，絕大多數(shù)的臨床試驗(yàn)仍然停留在臨床I期和臨床I/II期。
這些絕大多數(shù)的早期臨床試驗(yàn)為基因治療提供了無價(jià)的概念驗(yàn)證，確認(rèn)了對(duì)目標(biāo)細(xì)胞定向改變能夠成功的引起細(xì)胞表型的變化。然而在大多數(shù)的臨床功能試驗(yàn)中，基因改造細(xì)胞的數(shù)量還不足以達(dá)到治療的效果。盡管治療效果欠佳的報(bào)告數(shù)量有所增加但基因治療領(lǐng)域仍在繼續(xù)發(fā)展。其中zui值得注意的是幾種疾病，如原發(fā)性免疫缺陷、萊伯先天性黑蒙癥、血友病B、X連鎖的腎上腺腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良（X-ALD）的治療。X-ALD是一種致命的脫髓鞘中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，一部電影《洛倫佐的油》使得這一疾病為人所知。這是慢病素載體被成功應(yīng)用于治療人類的基因缺陷病的報(bào)道，也是嚴(yán)重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療*的巨大成功。
也有使用免疫治療方法成功的臨床試驗(yàn)報(bào)道，雖然接受治療的患者人群在2012年還很少。這些試驗(yàn)中，患者接受了工程改造后能夠識(shí)別腫瘤的T淋巴細(xì)胞，T淋巴細(xì)胞的這一功能是γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒載體編碼的直接針對(duì)腫瘤相關(guān)抗原的T細(xì)胞受體所賦予的。總體而言，臨床反應(yīng)變化多端，但重要的是，一小部分患者在接受治療后得到了緩和。嵌合抗原受體（CARs）在2012年時(shí)，作為基于自身靶向腫瘤相關(guān)細(xì)胞表面抗原的自體細(xì)胞療法進(jìn)已進(jìn)入臨床。費(fèi)城阿拉伯森癌癥研究中心的研究人員描述了18例患有慢性淋巴細(xì)胞白血病的病人中3例在接受自體淋巴細(xì)胞治療后獲得的良好早期結(jié)果。
表1. 已獲批的基因治療藥物
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基因治療的趨勢(shì)與當(dāng)前進(jìn)展
CAR-T細(xì)胞
自2012年開始，新增基因治療臨床試驗(yàn)754例。其中zui引人注目的領(lǐng)域當(dāng)屬利用CAR-T細(xì)胞靶向腫瘤相關(guān)細(xì)胞表面抗原的腫瘤的免疫治療。這一方案已受到廣泛關(guān)注，在許多其他腫瘤治療方案已經(jīng)失敗的情況下它能夠匯聚細(xì)胞毒T細(xì)胞的殺傷潛力和持久性與單克隆抗體的特異性以殺傷腫瘤。從2011年新英格蘭醫(yī)藥雜志報(bào)道了一例病人接受轉(zhuǎn)導(dǎo)了能夠表達(dá)B細(xì)胞特異性抗原CD19的自體T細(xì)胞輸注后達(dá)到*緩解后，已有數(shù)百名患者在多次試驗(yàn)中接受了CAR-T 19 這一激動(dòng)人心的治療方式，在患有白血病或淋巴瘤尤其是急性淋巴白血病的患者中達(dá)到了的緩解率。這一療法走向臨床成為“免疫療法”，被科學(xué)雜志評(píng)為2013年的突破性進(jìn)展。值得注意的是，到2017年5月，Emily Whitehead 作為*在費(fèi)城兒童醫(yī)院接受CAR-T細(xì)胞治療的兒科患者已經(jīng)5年沒有復(fù)發(fā)，并且*CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品-Kymriah也在2017年被FDA批準(zhǔn)上市。靶向?qū)嶓w瘤如膠質(zhì)母細(xì)胞瘤是目前治療中的一大挑戰(zhàn)，相關(guān)報(bào)道正日益增加。
Cellectis正致力用TALEN技術(shù)編輯健康人來源的T細(xì)胞嵌合抗原受體（CAR），以利用健康人的血液獲得“現(xiàn)成”的免疫療法產(chǎn)品。這一通用CAR-T的臨床試驗(yàn)于2017年2月獲得FDA的批準(zhǔn)，但由于出現(xiàn)受試者死亡案例，于2017年9月被FDA叫停?；颊叩乃酪蛑赶蛄酥委煱悬c(diǎn)CD123的選擇，而并不在于對(duì)“通用型”CAR的免疫反應(yīng)，因兩名患者均未報(bào)道有GvHD移植物抗宿主反應(yīng)。目前這款通用型CAR-T的研發(fā)仍然處于不確定狀態(tài)，但利用健康人血開發(fā)“通用”的腫瘤免疫療法對(duì)于免疫力低下而無法在自身血液中獲得足夠的T淋巴細(xì)胞的腫瘤患者而言仍是一個(gè)重要的發(fā)展方向。
如今，美國已將CAR-T療法納入醫(yī)保，F(xiàn)DA也批準(zhǔn)了CAR-T療法Kymriah的第二個(gè)適應(yīng)癥——復(fù)發(fā)或難治性大B細(xì)胞淋巴瘤。好消息仍在不斷傳來，cell雜志報(bào)道了一款SUPRA CAR-T。SUPRA CAR-T將T細(xì)胞從系統(tǒng)的靶點(diǎn)感知部分（the target-sensing portion of the system，SUPRA CAR-T系統(tǒng)中用于識(shí)別癌細(xì)胞上靶點(diǎn)的抗體部分）分離了出來，使系統(tǒng)擁有了切換靶點(diǎn)的能力。這一款通用型CAR-T是一種分離的、通用、可編程式(split,universal, and programmable，SUPRA)CAR 系統(tǒng)，用于T細(xì)胞治療。能夠很好地調(diào)控T細(xì)胞激活程度以消除毒性;能夠感知多種抗原并做出響應(yīng)以對(duì)抗癌癥復(fù)發(fā);還誘導(dǎo)控制細(xì)胞類型特異性的信號(hào)。這一系統(tǒng)的出現(xiàn)有望提供更安全、更有效的癌癥治療。
Cell（DOI: https://doi.org/10.1016/j.cell.2018.03.038）
Emily Whitehead 2013-2016
單基因遺傳病
自上次報(bào)道以來，單基因遺傳病在治療方面有了極大的穩(wěn)步進(jìn)展。截止2017年11月，11.1%的臨床試驗(yàn)集中在單基因遺傳病領(lǐng)域，而其在2012、2007和2004的歷史數(shù)據(jù)分別為全部試驗(yàn)的8.7%、8.3%和9.8%。
非病毒載體
在囊性纖維化的治療中，非病毒的基因治療能夠改善肺功能的概念已經(jīng)一個(gè)隨機(jī)的、雙盲、安慰劑對(duì)照的臨床IIB期試驗(yàn)驗(yàn)證。這一試驗(yàn)中，78例患者接受了陽離子脂質(zhì)體包裹的編碼CFTR cDNA的質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)導(dǎo)。盡管收效甚微并且僅在個(gè)別受試者身上起效，但這一試驗(yàn)證明了其安全性并為未來試驗(yàn)的改進(jìn)如增加劑量和頻次打下了基礎(chǔ)。
γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒載體
針對(duì)免疫缺陷的臨床試驗(yàn)仍在繼續(xù)顯示其顯著的臨床效果，超過150例合并缺陷患者接受了γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒和zui近基于慢病毒的基因轉(zhuǎn)移治療。在腺苷脫氨酶缺乏癥（ADA-SCID）的治療方面，超過40例患者接受了治療，疾病的存活率超過70%。值得注意的是，Struimviv（葛蘭素史克公司），基于里程碑式的米蘭試驗(yàn)已于2016年獲得了歐洲市場(chǎng)授權(quán)局（EMA）的市場(chǎng)批準(zhǔn)，代表了*個(gè)靶向干細(xì)胞的的基因治療體外方案在歐洲獲批。盡管經(jīng)過長(zhǎng)期的追蹤在ADA-SCID的治療中并沒有觀察到與載體的基因毒性相關(guān)的不良事件，但使用慢病毒進(jìn)行治療的臨床試驗(yàn)逐漸增多。使用慢病毒對(duì)原發(fā)性免疫缺陷如X連鎖重癥免疫缺陷（X1-SCID）和Wiskott-Aldrich的治療也有報(bào)道，并顯示出相對(duì)于γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒載體更好的安全性。
慢病毒載體
慢病毒載體在靶向造血干細(xì)胞治療遺傳性神經(jīng)疾病ALD和異染性白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良中的應(yīng)用也取得了可喜的成果，并且類似的方法也被用于血紅蛋白病的治療，包括鐮狀細(xì)胞病患者的早期報(bào)道。在藍(lán)鳥生物贊助的一項(xiàng)試驗(yàn)中，治療后15個(gè)月，鐮狀球蛋白β抗體的水平約為β球蛋白的一半，疾病表征也得到了糾正。β地中海貧血的基因治療，尤其是那些還殘存β球蛋白表達(dá)的病人的治療報(bào)道也令人充滿希望，范圍內(nèi)目前已經(jīng)開展了六項(xiàng)臨床試驗(yàn)。2018年4月19日新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志發(fā)表了哈佛醫(yī)學(xué)院Leboulch等研究組用BB305載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的自體CD34 +細(xì)胞的基因治療減少或消除了對(duì)22名患有嚴(yán)重β地中海貧血的患者長(zhǎng)期紅細(xì)胞輸血的需要，而沒有與藥物產(chǎn)品相關(guān)的嚴(yán)重不良事件。這一里程碑式的試驗(yàn)成功新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志的給予了高度贊賞，出版了專門的點(diǎn)評(píng)文章。目前世界上關(guān)于地中海貧血的基因治療還有兩粒臨床試驗(yàn)正在進(jìn)行中。由Meorial Solan Kattering醫(yī)院主導(dǎo)的臨床試驗(yàn)使用了相對(duì)溫和的清髓預(yù)處理方法，也獲得了與哈佛醫(yī)學(xué)院相似的滿意結(jié)果，而國內(nèi)的地中海貧血基因治療試驗(yàn)正在廣州南方醫(yī)院進(jìn)行。
AAV載體
基于腺相關(guān)病毒（AAV）載體的治療也在臨床相顯現(xiàn)了令人印象深刻的結(jié)果，這反映在一些專門的基因治療期刊中關(guān)于這一載體系統(tǒng)的特征性討論中。在這些試驗(yàn)中值得關(guān)注的包括α-1抗胰蛋白酶缺乏癥、血友病A和B以及眼科疾病的基因治療。用于治療脂蛋白脂酶缺乏癥的AAV載體在2012年獲得EMA批準(zhǔn)后已被uniQure公司市場(chǎng)化為Glybera。而美國*個(gè)基于AAV的基因治療產(chǎn)品voretigene neparvovec被Spark命名為L(zhǎng)uxturna，獲得了FDA咨詢委員會(huì)的一致認(rèn)可。該產(chǎn)品將人視網(wǎng)膜色素上皮特異性蛋白65 kDa（RPE65）cDNA遞送到雙眼視網(wǎng)膜下間隙治療視網(wǎng)膜營(yíng)養(yǎng)不良。在2017年10月19日，F(xiàn)DA授予了Luxturna的正式批文。
自2012年以來，血友病B（凝血因子IX缺失）的第二例臨床試驗(yàn)已由A C Nathwani和其同事發(fā)起（*自由醫(yī)院）。在該試驗(yàn)中，使用了血清型AAV8的病毒外殼以期比之前試驗(yàn)中使用的AAV2獲得更高的基因表達(dá)率。關(guān)鍵的是AAV8較之AAV2在人群中的預(yù)存抗體水平更低。該實(shí)驗(yàn)中，外周靜脈一次性注射表達(dá)凝血因子IX cDNA的由肝臟特異性啟動(dòng)子啟動(dòng)的AAV載體，能夠?qū)⒀獫{中凝血因子IX水平提升至治療水平（正常水平的1-6%），這一水平提升呈現(xiàn)劑量依賴性。高劑量注射能夠觀察到短暫的轉(zhuǎn)氨酶水平升高，隨后經(jīng)皮質(zhì)類固醇治療好轉(zhuǎn)。更多的血友病B的I/II期臨床試驗(yàn)使用了天然存在的Padua亢進(jìn)突變體進(jìn)行。在這些試驗(yàn)中，在兩個(gè)接受了高劑量載體注射的患者體內(nèi)觀察到了免疫反應(yīng)導(dǎo)致的轉(zhuǎn)基因表達(dá)下降，其中一個(gè)病人需要轉(zhuǎn)向傳統(tǒng)的凝血因子IX注射治療，而且從另一方面來講，盡管在10個(gè)受試者中觀察到兩個(gè)肝酶水平無癥狀的增加，但能夠通過短期皮質(zhì)類固醇治療來解決。AAV9血清型的重組AAV病毒藉治療神經(jīng)性脊髓型肌萎縮癥（SMA）162型和圣菲力波綜合征A型（MPS IIIa）走向臨床，說明這種病毒能夠有效地跨越人的血腦屏障，在小鼠模型中也獲得了一致的結(jié)果。
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對(duì)基因治療興趣的恢復(fù)
近年來，產(chǎn)業(yè)和分出公司對(duì)基因治療的興趣，這反映了對(duì)這一領(lǐng)域信心的增加。這些信心來源于基于治療效果的越來越多的報(bào)道和*基因治療產(chǎn)品如EMA2012年批準(zhǔn)的Glybera®（uniQure）和2016年治療ADA-SCID的SrimoSmithLe（葛蘭素史克）的上市。更近一些，諾華研發(fā)的*CAR T細(xì)胞治療產(chǎn)品Kymriah（之前名為tisagenlecleucel-T 和CTL019）于2017年8月獲FDA批準(zhǔn)。緊接著，由Kite Pharma研發(fā)的商品名為Yescarta的CAR-T治療產(chǎn)品和Spark Therapeutics 的Luxturna分別在10月和12月獲得FDA批準(zhǔn)上市。學(xué)術(shù)界也獲得了越來越多的行業(yè)資助，進(jìn)一步拓展了基因治療藥物的研發(fā)管線。隨著臨床思維的變革，大量的投資開始進(jìn)入基因治療領(lǐng)域，如優(yōu)化生產(chǎn)工藝以擴(kuò)大獲得治療人類疾病所需的病毒載體的生產(chǎn)規(guī)模并確保商業(yè)化的生產(chǎn)方法對(duì)新載體適用。國內(nèi)方面，五加和對(duì)中國的基因治療提供AAV、HSV、LENTI、ADV載體系統(tǒng)中試及規(guī)?；d體生產(chǎn)平臺(tái)，可以為基因治療產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展提供支撐。臨床醫(yī)藥中基因治療的信心增加也引發(fā)了生物醫(yī)藥領(lǐng)域?qū)τ跐撛讷@利的疾病指征的激烈競(jìng)爭(zhēng)，以利用AAV載體治療凝血因子缺乏的血友病A和血友病B為例，至少10家公司分別啟動(dòng)或宣稱計(jì)劃開展臨床試驗(yàn)。
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進(jìn)化的技術(shù)與新的基因治療平臺(tái)
基因修復(fù)
自2012年以來，一個(gè)重要的模式變化在于更多的關(guān)注集中在基因補(bǔ)充策略的改變，包括基因編輯和目標(biāo)基因重組，反義寡核苷酸誘導(dǎo)外顯子跳躍以及RNA干擾，這些方案現(xiàn)已全部進(jìn)入臨床。在簡(jiǎn)單增加功能正常的基因不足以改善的顯性疾病過程中，這一策略非常重要。RNAi的重要性（例如基因下調(diào)基因表達(dá)）在2006和梅洛獲得諾貝爾生理和醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)時(shí)被認(rèn)可。雖然這些方法的效率通常不足以進(jìn)行人類疾病的基因治療，但在使用寡核苷酸誘導(dǎo)的外顯子跳躍治療假肥大型肌營(yíng)養(yǎng)不良癥（DMD）方面和關(guān)于SMA治療的典型案例已被報(bào)道出來并在zui近的分子治療周年紀(jì)念版中進(jìn)行了綜述。2016，F(xiàn)DA批準(zhǔn)了兩種剪接調(diào)節(jié)寡核苷酸用于治療神經(jīng)肌肉疾病。*個(gè)是Eteplirsen (Sarepta Therapeutics)，盡管有爭(zhēng)議但仍獲得了FDA的優(yōu)先審批，用磷酰二胺嗎啉反義寡核苷酸治療DMD。而用于治療SMA患者的nusinersen (由Biogen市場(chǎng)化的Spinraza)則在提出新藥申請(qǐng)后3個(gè)月就被接收，并且不需轉(zhuǎn)至FDA咨詢委員會(huì)。
基因編輯
自*個(gè)特異性的核酸酶被證明能夠結(jié)合DNA并使雙鏈斷裂以來已近二十年的時(shí)間，這極大的促進(jìn)了位點(diǎn)特異性基因編輯的發(fā)展。核酸酶誘導(dǎo)的基因斷裂不僅可以用基因添加和基因破壞，還可用于基因修復(fù)。盡管需要長(zhǎng)期隨訪，但基因編輯技術(shù)的前景看好，這一技術(shù)已被應(yīng)用于治療HIV-193和轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)核酸酶的臨床試驗(yàn)中，用以治療兩個(gè)患有晚期白血病的兒童。zui近，一種用于細(xì)菌免疫系的規(guī)則相間的短回文重復(fù)基因簇相關(guān)cas9（CRISPR/CAS
9）核酸酶顯著提高了基因組編輯的效率，盡管在30年前被報(bào)道時(shí)僅被作為iap基因下游的一組不尋常核苷酸序列。這一細(xì)菌免疫系統(tǒng)被重新定義，導(dǎo)致了基因編輯技術(shù)的持續(xù)革命。根據(jù)報(bào)道，為了生產(chǎn)更安全的異種移植組織，CRISPR/Cas9已被用于超過60種豬內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒的滅活中。zui近，CRISPR/CAS9修飾的細(xì)胞用于人類治療癌癥。2016年10月28日，四川大學(xué)盧勇團(tuán)隊(duì)將CRISPR/Cas9改造的T細(xì)胞輸入病人體內(nèi)以治療轉(zhuǎn)移性肺癌（試驗(yàn)號(hào)NCT02793856）,國內(nèi)還有另外7個(gè)針對(duì)實(shí)體瘤的臨床試驗(yàn)計(jì)劃進(jìn)行。SangaMo療法也開始使用鋅指核酸酶將序列導(dǎo)入白蛋白位點(diǎn)治療粘多糖沉積癥和血友病B（試驗(yàn)號(hào)分別為：NCT03041324, NCT02702115 和 NCT02695160）。盡管仍處于臨床前階段，但使用非同源末端糾正致病性剪接位點(diǎn)突變已被報(bào)道用于治療小鼠1A性先天性肌營(yíng)養(yǎng)不良癥并在一些案例中可能zui終取代使用寡核苷酸誘導(dǎo)的外顯子跳躍。該技術(shù)的進(jìn)一步改進(jìn)，如鑒定具有減少的靶向效應(yīng)的替代核酸酶，已經(jīng)顯示了其基因治療應(yīng)用的潛力，但對(duì)大量的細(xì)胞進(jìn)行的位點(diǎn)修復(fù)以獲得治療效果仍是對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的挑戰(zhàn)。zui開始利用CRISPR/Cas9對(duì)人類胚胎進(jìn)行基因編輯的是中國，zui近美國也有相關(guān)報(bào)道。
日益增長(zhǎng)的轉(zhuǎn)基因表達(dá)需求
基因傳遞系統(tǒng)可分為兩大類：非病毒的物理化學(xué)方法與重組病毒系統(tǒng)。非病毒方法的比較優(yōu)勢(shì)包括化學(xué)特性的簡(jiǎn)化、生產(chǎn)的簡(jiǎn)單性和再現(xiàn)性、更大的包裝容量和能減少生物安全方面的擔(dān)憂。然而與重組病毒系統(tǒng)相比非病毒方法相對(duì)低效且往往效果短暫。然而核酸穩(wěn)定性和效力的提高以及脂質(zhì)和聚合物遞送技術(shù)的進(jìn)步，正在推進(jìn)非病毒基因遞送系統(tǒng)的發(fā)展。相較與此，為了使病毒系統(tǒng)復(fù)制能力缺失、效率更高以及更好的利用其有利的一面，病毒系統(tǒng)常有修改。根據(jù)所需修飾的性質(zhì)，核酸、寡核苷酸、適體、轉(zhuǎn)錄因子和其他分子的瞬時(shí)遞送是非?？赡軐?shí)現(xiàn)的。例如，使用非整合載體、瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)和小分子將轉(zhuǎn)錄因子傳遞到誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPS），其安全性問題的解決在于消除編碼轉(zhuǎn)錄因子不必要的長(zhǎng)期表達(dá)和插入誘變的可能性。通過限制潛在的脫靶效應(yīng)，Cas9和其他DNA內(nèi)切酶在基因組編輯中的瞬時(shí)表達(dá)也可能是有利的，這正在被廣泛地研究。
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