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色譜法的基本原理：
利用樣品混合物中各組分理、化性質(zhì)的差異，各組分程度不同的分配到互不相溶的兩相中。當(dāng)兩相相對(duì)運(yùn)動(dòng)時(shí)，各組分在兩相中反復(fù)多次重新分配，結(jié)果使混合物得到分離。
兩相中，固定不動(dòng)的一相稱固定相;移動(dòng)的一相稱流動(dòng)相。
分類：
根據(jù)兩相的物態(tài)類型，有液-固色譜和液-液色譜兩類基本色譜方法。
液-固色譜的固定相是粉末狀或顆粒狀固體，具有表面吸附活性，流動(dòng)相是液體?；旌衔镏懈鹘M分在固定相表面上的吸附強(qiáng)度不同，當(dāng)流動(dòng)相流過(guò)時(shí)各組分隨流動(dòng)相的移動(dòng)速度不同而實(shí)現(xiàn)分離。柱色譜、薄層色譜大都屬于這類色譜。
液-液色譜的固定相是附著于載體的液層，流動(dòng)相是另一種液體?；旌衔镏懈鹘M分在兩液相間的分配系數(shù)不同，則在兩液相中的濃度不同，隨流動(dòng)相移動(dòng)的速度也不同，從而實(shí)現(xiàn)分離。紙色譜和有些薄層色譜屬于這類色譜。
一、液-固色譜原理
液-固色譜是基于吸附和溶解性質(zhì)的分離技術(shù)，柱色譜屬于液-固吸附色譜。
當(dāng)混合物溶液加在固定相上，固體表面借各種分子間力(包括范德華力和氫鍵)作用于混合物中各組分，以不同的作用強(qiáng)度被吸附在固體表面。
柱色譜分離原理
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由于吸附劑對(duì)各組分的吸附能力不同，當(dāng)流動(dòng)相流過(guò)固體表面時(shí)，混合物各組分在液-固兩相間分配。吸附牢固的組分在流動(dòng)相分配少，吸附弱的組分在流動(dòng)相分配多。流動(dòng)相流過(guò)時(shí)各組分會(huì)以不同的速率向下移動(dòng)，吸附弱的組分以較快的速率向下移動(dòng)。隨著流動(dòng)相的移動(dòng)，在新接觸的固定相表面上又依這種吸附-溶解過(guò)程進(jìn)行新的分配，新鮮流動(dòng)相流過(guò)已趨平衡的固定相表面時(shí)也重復(fù)這一過(guò)程，結(jié)果是吸附弱的組分隨著流動(dòng)相移動(dòng)在前面，吸附強(qiáng)的組分移動(dòng)在后面，吸附特別強(qiáng)的組分甚至?xí)浑S流動(dòng)相移動(dòng)，各種化合物在色譜柱中形成帶狀分布，實(shí)現(xiàn)混合物的分離。
二、柱色譜分離條件
氧化鋁對(duì)有機(jī)物的作用類型
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⑴ 固定相選擇
柱色譜使用的固定相材料又稱吸附劑。
吸附劑對(duì)有機(jī)物的吸附作用有多種形式。以氧化鋁作為固定相時(shí)，非極性或弱極性有機(jī)物只有范德華力與固定相作用，吸附較弱;極性有機(jī)物同固定相之間可能有偶極力或氫鍵作用，有時(shí)還有成鹽作用。這些作用的強(qiáng)度依次為：
成鹽作用 > 配位作用 > 氫鍵作用 > 偶極作用 > 范德華力作用。 有機(jī)物的極性越強(qiáng)，在氧化鋁上的吸附越強(qiáng)。
表1：各種吸附劑對(duì)于極性有機(jī)物的吸附作用強(qiáng)度
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常用吸附劑有氧化鋁、硅膠、活性炭等(表1)。
色譜用的氧化鋁可分酸性、中性和堿性三種。酸性氧化鋁pH約為4-4.5，用于分離羧酸、氨基酸等酸性物質(zhì);中性氧化鋁pH值為7.5，用于分離中性物質(zhì)，應(yīng)用zui廣;堿性氧化鋁pH為9-10，用于分離生物堿、胺和其它堿性化合物等。
吸附劑的活性與其含水量有關(guān)。含水量越低，活性越高。脫水的中性氧化鋁稱為活性氧化鋁。
硅膠是中性的吸附劑，可用于分離各種有機(jī)物，是應(yīng)用的固定相材料之一。
活性炭常用于分離極性較弱或非極性有機(jī)物。
吸附劑的粒度越小，比表面越大，分離效果越明顯，但流動(dòng)相流過(guò)越慢，有時(shí)會(huì)產(chǎn)生分離帶的在重疊，適得其反。
⑵ 流動(dòng)相選擇
色譜分離使用的流動(dòng)相又稱展開劑 。
展開劑對(duì)于選定了固定相的色譜分離有重要的影響。
各種展開劑對(duì)極性有機(jī)物的溶解能力
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在色譜分離過(guò)程中混合物中各組分在吸附劑和展開劑之間發(fā)生吸附-溶 解分配，強(qiáng)極性展開劑對(duì)極性大的有機(jī)物溶解的多，弱極性或非極性展開劑對(duì)極性小的有機(jī)物溶解的多，隨展開劑的流過(guò)不同極性的有機(jī)物以不同的次序形成分離帶。
在氧化鋁柱中，選擇適當(dāng)極性的展開劑能使各種有機(jī)物按先弱后強(qiáng)的極性順序形成分離帶，流出色柱。
當(dāng)一種溶劑不能實(shí)現(xiàn)很好的分離時(shí)，選擇使用不同極性的溶劑分級(jí)洗脫。 如一種溶劑作為展開劑只洗脫了混合物中一種化合物，對(duì)其它組分不能展開洗脫，需換一種極性更大的溶劑進(jìn)行第二次洗脫。這樣分次用不同的展開劑可以將各組分分離。
一、薄層色譜概念 zui常用的薄層色譜也屬于液-固吸附色譜。同柱色譜不同的是吸附劑被涂布在玻璃板上，形成薄薄的平面涂層。干燥后在涂層的一端點(diǎn)樣，豎直放入一個(gè)盛有少量展開劑的的有蓋容器中。展開劑接觸到吸附劑涂層，借毛細(xì)作用向上移動(dòng)。與柱色譜過(guò)程相同，經(jīng)過(guò)在吸附劑和展開劑之間的多次吸附-溶解作用，將混合物中各組分分離成孤立的樣點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)混合物的分離。
薄層色譜原理圖
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除了固定相的形狀和展開劑的移動(dòng)方向不同以外，薄層色譜和柱色譜在分離原理上基本相同。由于薄層色譜操作簡(jiǎn)單，試樣和展開劑用量少，展開速度快，所以經(jīng)常被用于探索柱色譜分離條件和監(jiān)測(cè)柱色譜過(guò)程。
二、薄層色譜條件
⑴固定相選擇
柱色譜中提到的吸附劑都可以用作為薄層色譜的固定相，分離性能及使用選擇同柱色譜的選擇原則相同(各種吸附劑見柱色譜表1)。
一般用于薄層色譜時(shí)，要求吸附劑的粒度更小。商品吸附劑區(qū)分為色譜級(jí)(用于柱色譜)和薄層色譜級(jí)(用于薄層色譜)。
⑵展開劑選擇
薄層色譜展開劑的選擇和柱色譜一樣，主要根據(jù)樣品中各組分的極性、溶劑對(duì)于樣品中各組分溶解度等因素來(lái)考慮。展開劑的極性越大，對(duì)化合物的洗脫力也越大。(各種溶劑極性見柱色譜表2)。
選擇展開劑時(shí)，除參照表列溶劑極性來(lái)選擇外，更多地采用試驗(yàn)的方法，在一塊薄層板上進(jìn)行試驗(yàn)：
①若所選展開劑使混合物中所有的組分點(diǎn)都移到了溶劑前沿，此溶劑的極性過(guò)強(qiáng);
②若所選展開劑幾乎不能使混合物中的組分點(diǎn)移動(dòng)，留在了原點(diǎn)上，此溶劑的極性過(guò)弱。
當(dāng)一種溶劑不能很好地展開各組分時(shí)，常選擇用混合溶劑作為展開劑。先用一種極性較小的溶劑為基礎(chǔ)溶劑展開混合物，若展開不好，用極性較大的溶劑與前一溶劑混合，調(diào)整極性，再次試驗(yàn)，直到選出合適的展開劑組合。合適的混合展開劑常需多次仔細(xì)選擇才能確定。
⑶相對(duì)移動(dòng)值 從點(diǎn)樣原點(diǎn)開始到展開后的溶劑前沿，是溶劑的移動(dòng)距離，記為lo，混合物中各組分的移動(dòng)距離分別記為l1，l2，l3 …(移動(dòng)值示意圖)。
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移動(dòng)值示意圖
在不同的展開條件下，各化合物的移動(dòng)距離不會(huì)相同，而在同一條件下，相對(duì)于展開劑的移動(dòng)距離，各化合物有可比較的展開數(shù)據(jù)，稱為相對(duì)移動(dòng)值，或比移值：
Rf=li/lo
在相同條件下測(cè)得的比移值可以用于化合物的薄層色譜特征值進(jìn)行比較對(duì)照。
⑷顯色
分離的化合物若有顏色，很容易識(shí)別出來(lái)各個(gè)樣點(diǎn)。但多數(shù)情況下化合物沒有顏色，要識(shí)別樣點(diǎn)，必須使樣點(diǎn)顯色。通用的顯色方法有碘蒸氣顯色和紫外線顯色。
①碘蒸氣顯色：將展開的薄層板揮發(fā)干展開劑后，放在盛有碘晶體的封閉容器中，升華產(chǎn)生的碘蒸氣能與有機(jī)物分子形成有色的締合物，完成顯色。
②紫外線顯色：用摻有熒光劑的固定相材料(如硅膠F，氧化鋁F等)制板，展開后在用紫外線照射展開的干燥薄層板，板上的有機(jī)物會(huì)吸收紫外線，在板上出現(xiàn)相應(yīng)的色點(diǎn)，可以被觀察到。
有時(shí)對(duì)于特殊有機(jī)物使用的顯色劑顯色。此時(shí)常用盛有顯色劑溶液的噴霧器噴板顯色。
三、薄層色譜操作 (見 視頻“色譜裝置與操作”)
⑴制板(以硅膠板為例)
選擇合適的玻璃板(經(jīng)常使用顯微鏡上的載玻片)，依次用水和乙醇洗凈，晾干。取適量薄層色譜用的硅膠，加適量蒸餾水調(diào)成糊。調(diào)制時(shí)慢慢攪拌，勿使產(chǎn)生氣泡。將糊倒在玻璃板上，搖動(dòng)攤平，晾干。使用前放入烘箱內(nèi)，在105-115oC左右烘干40-50分鐘。冷卻后使用。
⑵點(diǎn)樣
將試樣用zui少量展開劑溶解，用毛細(xì)管蘸取試樣溶液，在薄層板上點(diǎn)樣。在樣點(diǎn)上輕輕畫出一條平行于玻璃板底邊的細(xì)線。薄層色譜板載樣量有限，勿使點(diǎn)樣量過(guò)多。
⑶展開
吹干樣點(diǎn)，豎直放入盛有展開劑的有蓋展開瓶中。展開劑要接觸到吸附劑下沿，但切勿接觸到樣點(diǎn)。蓋上蓋子，展開。待展開劑上行到一定高度(由試驗(yàn)確定適當(dāng)?shù)恼归_高度)，取出薄層板，再畫出展開劑的前沿線。
⑷顯色，計(jì)算Rf值
揮發(fā)干展開劑，選擇合適的顯色方法顯色。量出展開劑和各組分的移動(dòng)距離，計(jì)算各組分的相對(duì)移動(dòng)值。
四、薄層色譜應(yīng)用
⑴可用于判斷兩個(gè)化合物是否相同(同一展開條件下是否有相同的移動(dòng)值);
⑵可用于確定混合物中含有的組分?jǐn)?shù);
⑶可用于為柱色譜選擇合適的展開劑，監(jiān)視柱色譜分離狀況和效果;
⑷可用于檢測(cè)反應(yīng)過(guò)程。
紙色譜屬于液一液分配色譜。
紙色譜使用的濾紙是載體，附著在紙上的水是固定相。樣品溶液點(diǎn)在紙上，作為展開劑的有機(jī)溶劑自下而上移動(dòng)，樣品混合物中各組分在水-有機(jī)溶劑兩相發(fā)生溶解分配，并隨有機(jī)溶劑的移動(dòng)而展開，達(dá)到分離的目的。
選擇紙色譜條件主要是選擇合適的展開劑。
合適的展開劑一般有一定的極性，但難溶于水。在有機(jī)溶劑和水兩相間，不同的有機(jī)物會(huì)有不同的分配性質(zhì)。水溶性大或能形成氫鍵的化合物，在水相中分配得多，在有機(jī)相中分配少;極性弱的化合物在有機(jī)相中分配多。展開劑劑借毛細(xì)管的作用沿濾紙上行時(shí)，帶著樣品中的各組分以不同的速度向上移動(dòng)。水溶性大或能形成氫鍵的化合物移動(dòng)得較慢，極性弱的化合物移動(dòng)得較快。隨展開劑的不斷上移，混合物中各組分在兩相之間反復(fù)進(jìn)行分配，從而把各組分分開(溶劑極性選擇見柱色譜表2)。
紙色譜在糖類化合物、氨基酸和蛋白質(zhì)、天然色素等有一定親水性的化合物的分離中有廣泛的應(yīng)用。
紙色譜的操作與薄層色譜很相似，只是紙色譜的載樣量比薄層色譜更小些。
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